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霉菌孢子长出秘籍

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发表于 2019-4-17 14:59:13 | 显示全部楼层 |阅读模式
作者:石决明
编辑:兔兔子
来源:实验助手app

在实验助手App中曾经看到下图的问题:黑曲霉超过了《中国药典》2015年版通则1101中规定的“20-25℃培养5-7天”,仍然是白色(没有长出孢子,还是菌丝)或者孢子长出但没有变黑。在别的网络平台上也有人有同样的问题。黑曲霉的生长活力一直被人所诟病。

好消息是在《中国药典》2020年版第二次的征求意见稿中增加了一句话“或直到获得丰富的孢子”,给培养时间增加了足够的空间。但是,是不是只要增加时间就可以获得丰富的黑曲霉孢子呢? 如果你没搞清楚这背后的原因,估计多几天也没用。

首先,我们需要了解曲霉属真菌的生长阶段特点。如下图所示,产生分生孢子是整个生长周期的最后一个阶段。如果之前菌丝没有长好、分生孢子梗没有形成,孢子就不可能出现。

其次,我们需要重新认识黑曲霉。黑曲霉,半知菌亚门,丝孢纲,丝孢目,丛梗孢科,曲霉属真菌中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。是重要的发酵工业菌种,可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。能成功用于工业发酵就说明通过生长条件的优化,黑曲霉可以实现大量快速的培养。就如同我们在现实生活中看到的一样,积压过受伤的水果是很容易发霉的,又比如潮湿的天气中墙壁表面或者浴室角落也很容易发霉。能利用于工业发酵还说明另一方面的问题,就是黑曲霉也是可控的,并没有那么可怕。生物安全方面的内容欢迎去实验助手App收听课程直播。
最后,最重要是了解一下黑曲霉的生长条件。
1、黑曲霉是严格的好氧微生物,对环境中溶氧分压及其变化(溶解氧是液体发酵培养的重要指标)很敏感。液体培养基进行发酵时需要泵入氧气或者在玻璃瓶中进行摇床培养。实验室试管固体斜面静置培养时,注意试管塞要透气,并且斜面不要装载过高,留有足够的空间。
2. 黑曲霉是嗜温嗜湿微生物,最适生长温度在28℃左右,最低相对湿度为88%。也有文献报道最适生长温度是30℃,如下图30℃具有明显的生长优势。但是要注意一下,黑曲霉也分具体的菌株,下图中发酵用黑曲霉培养温度经过实验优化后确定是30℃更好。而USP中的Aspergillus brasiliensis(ATCC® 16404™)以COA中20-25℃为准,CMCC ( F ) 98 003也是以《中国药典》2015年版中20-25℃为准。在这些温度范围内可以尝试优化温度条件。  

液体培养基培养时可以满足高湿度的要求,但是如果是静置培养,液面以下的氧气(溶解氧)供应容易不足,会表现出生长不良。
3、 天然培养基更适合黑曲霉的生长。比如ATCC® 16404™的COA中推荐的培养基分别是Potato dextrose agar(PDA 马铃薯培养基)、Malt extract agar (麦芽提取培养基)和Emmons' modification of Sabouraud's aga(中性pH范围的SDA)。中国典型培养物保存中心(CCTCC)也推荐PDA培养基进行黑曲霉的培养。

总结:
足够的氧气、合适的温度、高湿度和天然培养基可以有利于黑曲霉的生长,生长跨过足够的生长阶段,就可以产生丰富的孢子。

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